ELISA, tıp ve biyoteknoloji alanlarında kullanılan bir tanı testiyken; aynı zamanda peptitler, proteinler, antikorlar ve hormonlar gibi çözünebilir maddeleri ölçmek ve tespit etmek için yapılan bir analiz yöntemidir. ELISA için ‘Enzim immunoassay (EIA)’ gibi isimler de kullanılmaktadır. Hedef maddeleri tanımlamak için antikorlar ve renk değişiklikleri kullanılan testte, antijen ve antikor konsantrasyon ölçümleri de yapılmaktadır. [1,2]
ELISA, bir karışımdaki belirli bir proteini saptamak ve ölçmek için tercih edilen bir yöntemdir. ELISA'da, hedef molekül katı bir yüzey (mikroplaka) üzerinde hareketsizleştirilir. Daha sonra bir raportör enzime bağlı antikor ile kompleks haline getirilir. Testin duyarlılığı ve kesinliği, plakanın yüksek afiniteli antikorlarla kaplanmasıyla artırılır. [2]
Şekil 1: ELISA örneği. [3]
ELISA'lar 96 oyuklu veya 384 oyuklu polistiren plakalarda gerçekleştirilir. Bu plakalar antikorları ve proteinleri pasif olarak bağlayarak hem ELISA'ları tasarlamayı, hemde ELISA’nın gerçekleşmesini kolaylaştırır. ELISA reaktanlarının mikroplakalar yüzeyine immobilizasyonla hareketsiz hale getirilmesi, yüzeye bağlı olmayan malzemelerin daha kolay uzaklaştırılmasını sağlar. ELISA, yüksek afiniteli antikorları kullanma ve spesifik olmayan bağlı materyalleri yıkama yeteneği ile ham bir preparat içindeki spesifik analitleri ölçmek için tercih edilen güçlü bir araçtır. [2]
Temel ELISA Basamakları [4]
1. Antikor Kaplama
Antijenlerin gece boyunca polistiren mikroplaka kuyularının yüzeyine doğrudan veya dolaylı olarak immobilizasyonu yapılır.
2. Protein Yakalama
Numuneler kuyucuklara eklenir ve bağlı antikorlar tarafından yakalanırlar.
3. Tespit Antikoru
Yakalanan proteinin tespit edilmesi için kuyucuklara spesifik saptama antikoru eklenir.
4. Streptavidin-Enzim Eşleniği
Saptama antikoru tarafından tanınan antijen, yine bu antikor sayesinde biyotin ve streptavidin-HRP'ye bağlanacaktır.
5. Substratın Eklenmesi
Oyuklara kolorimetrik substrat eklenir ve enzim tarafından katalize edildiğinde renkli bir çözelti oluşturur.
6. Analiz
Absorbans değerleri bir ELISA okuyucusunda ölçülür ve numunelerdeki protein miktarı bu sayede belirlenmiş olur.
ELISA Çeşitleri [5]
1. Doğrudan ELISA
Antijen, çok oyuklu plakanın yüzeyinde hareketsizleştirilir ve antijene özgü bir antikorla saptanır. Antikor, doğrudan HRP veya diğer saptama moleküllerine konjuge edilir.
Avantajları
Hızlı ve minimum adımla gerçekleştirilir.
Minimum öncül gereksinimi ile daha az hata verir.
2. Dolaylı ELISA
Doğrudan ELISA deneylerinde olduğu gibi, antijen, çok oyuklu plakanın yüzeyine sabitlenir. İki aşamalı bir tekniktir, antijen için spesifik bir birincil antikor hedefe bağlanır. Daha sonra ikincil antikor spesifik olarak birincil antikora bağlanır. Yöntem ayrıca, bir serum numunesindeki spesifik antikorları saptamak için kullanılabilir.
Avantajları
Birkaç ikincil antikor, bir birincil antikora bağlanabildiğinden ve bir tür ikincil antikor farklı birincil antikor için kullanılabildiğinden yüksek hassasiyet ve esneklik sunar
Daha az antikora ihtiyaç duyulduğundan daha ucuzdur.
3. Sandviç ELISA
Sandviç ELISA'lar, monoklonal veya poliklonal bir antikor olabilen yakalama antikoru ve saptama antikoru gibi antikor çiftlerinin kullanımını gerektirir. Antikorlardan biri, çok oyuklu plakanın yüzeyindeki yakalama antikorudur. Diğer antikor, saptama antikorudur ve antijenin saptanmasını kolaylaştırır.
Avantajları
Doğrudan veya dolaylı ELISA'ya kıyasla yüksek hassasiyet sunar.
İki antikorun katılımı nedeniyle oldukça spesifik reaksiyon sağlar.
Karmaşık numuneler için uygundur.
4. Rekabetçi ELISA
Rekabetçi ELISA testleri, belirli bir numunedeki antijen veya antikor konsantrasyonunu, sonuçta ortaya çıkan çıktının varsayılan sinyal çıktısına dayalı olarak ölçer ve nicelendirir. Önceki formatların her biri rekabetçi formata uyarlanabilir. Temel olarak, etiketli bir antikor yerine etiketli antijen kullanır. Etiketli antijen ve numune antijen (etiketsiz), birincil antikora bağlanmak için rekabet eder. Örnekteki antijen miktarı ne kadar düşükse, kuyudaki daha fazla etiketli antijen nedeniyle sinyal o kadar güçlüdür.
Avantajları
Deneysel hatalara daha az duyarlı.
İyi tekrarlanabilirlik ve esneklik sunar.
Küçük antijenler için uygundur.
Şekil 2: ELISA çeşitleri görüntüsü [5]
Kaynakça
https://www.mybiosource.com/learn/ELISA (Erişim Tarihi: 06.03.2021)
http://nortec.com.tr/%C3%9Cr%C3%BCnler.html (Erişim Tarihi: 06.03.2021)
https://www.mabtech.com/knowledge-center/assay-principles/elisa-assay-principle/elisa-step-step (Erişim Tarihi: 06.03.2021)
https://www.abcam.com/kits/elisa-principle (Erişim Tarihi: 07.03.2021)