Santral dogmanın adımlarından birisi olan translasyon, hücrede gerçekleşen protein üretimine denilmektedir. Translasyon başlangıç, ilerleme, terminasyon ve geri dönüşüm olarak dört ana adımda gerçekleşmektedir. Başlangıç aşamasında sitoplazmada bulunan serbest ribozom sayısını etkilediği için translasyon hızını kritik olarak etkileyen bir adımdır. Maksimum translasyon hızının sağlanabilmesi için başlangıç ve uzama adımlarının olabildiğince kısa olması gerekmektedir. Protein üretim hızının artması için özellikle türler arası gen ekspresyonlarında kodon optimizasyonu yapılmaktadır. Ancak kodon optimizasyonu uzama aşamasının hızını etkilemekte olup başlangıç hızını etkilememektedir [1,2].
Maksimum translasyon hızının sağlanabilmesi için hem başlangıç aşamasının hem de uzama aşamasının optimize edilmesi gerekmektedir. Başlangıç aşamasını, hücre metabolizması ve başlangıç kodonu yakınlarındaki mRNA sekansı etkilemektedir. Hücrelere gerekli ihtiyaçlarını karşılayan besinler verildiğinde serbest ribozom miktarı artarak protein üretim hızı ve replikasyon hızı artmaktadır. Bu durum sadece hedef genin üretim hızını değil hücredeki tüm proteinlerin üretim hızını etkilemektedir. Bakterilerde başlangıç kodonunun yakınlarında bulunan ribozomal bağlanma bölgesi (RBS) translasyon başlangıç hızı için hayati öneme sahiptir. RBS bölgesine yapılan değişiklikler spesifik olarak hedef genin üretim hızını değiştirilmesi sağlanmaktadır. Ribozomal bağlanma bölgesi başlangıç kodonundan en az 35 nt yukarısında olup +1’e kadar uzanabilmektedir. Başlangıç kodonunun 35 nt öncesi ve sonrası başlangıç hızını etkilemektedir. Başlangıçta ribozom, mRNA’nın başlangıç kodunun yaklaşık 35 nt öncesinden 19-22 nt sonrasına kadar olan bölgeyi hidroksil radikallerden korur. RBS bölgesi bekleme bölgesi, 16S rRNA bağlanma bölgesi, boşluk ve başlangıç kodonundan oluşur (şekil 1) [3].
Şekil 1. RBS bölgesinin şeması. Sırasıyla; bekleme bölgesi, 16s rRNA bağlanma bölgesi, boşluk, ve başlangıç kodonu [2].
mRNA kendi içerisinde oluşturduğu ikincil yapılar sebebiye sadece mikrosaniye sürelerinde düz formda bulunmaktadır. Bu kısa sürelerde 30S alt parçasının bağlanması için fırsat olmaktadır ancak tek başına yeterli değildir. RBS’de bulunan bekleme bölgesine bağlanarak difüze olmayan aşağı doğru bir kayma gerçekleştirir. Ancak bekleme bölgesinde gerçekleşecek ikincil yapı translasyon başlangıcı zorlaştırmaktadır.
Başlangıç öncesi 30S kompleksi mRNA’da ilerlerken birçok kovalent olmayan bağlar oluşmakta ve kırılmaktadır. Başlangıç öncesi kompleksinin stabilitesi ve başlangıç hızı bu bağlar arasındaki enerjiye bağlıdır. Başlangıç kompleksinin birleşme hızı mRNA’nın RBS bölgesini sterik açılmasına bağlı olup açılması ile birleşme hızı azalmaktadır. RBS bölgesinde katlanmalara sebep olan hidrojen bağları translasyonun başlamasını zorlaştırıp hızını azaltmaktadır.
Bakterilerde başlangıç aşamasında 30S ve 50S ribozom alt üniteleri başlangıç faktörleri yani IF1, IF2, IF3 yardımı ile mRNA’ya bağlanır ve translasyon başlar. IF1 aynı zamanda bilinmeyen bir sebepten dolayı 70S ribozomların alt parçalarına ayrılmasını hızlandırarak dolaylı şeklinde bir sonraki başlangıç öncesi 30S kompleksinin oluşumunu da hızlandırır. IF2 ise ribozomal alt ünitelerin hızlı bir şekilde birbirine bağlanmasını sağlamaktadır. IF3, hem başlangıç öncesi kompleksin oluşumu hem de ribozomal geri dönüşümün hızlanmasında yer almaktadır. Başlatıcı tRNA’nın AUG, GUG, UUG haricinde başlangıç kodonlara bağlanması durumunda ayrılmayı hızlandırdığı çalışmalar sonucunda bulunmuştur [1].
Yapılan çalışmalarda başlatıcı tRNA’nın mRNA bağlı 30S alt parçasına olan afinitesinin başlangıç faktörlerinin varlığında Kd= 2.7 nM, yokluğunda ise Kd=3.6 nM afinite göstermektedir. Başlangıç faktörlerinin afiniteye etkisi düşük olup, translasyona olan etkisi translasyonunu başlangıç hızını artırarak göstermektedir. Üç başlangıç faktörü aynı anda bulunduğu durumda translasyon başlangıç hızı 400 kat artmıştır.
IF3’ün kendiliğinden 30S başlangıç öncesi kompleksinden ayrılması alt parçaların birleşmesi için gereklidir. 50S ve IF3 eksik 30S ribozomal alt parçalarının birleşmesi için 30S başlangıç öncesi kompleksinden başlatıcı tRNA bulunması bağlanma ihtimalini büyük ölçüde artırdığı gözlemlenmiştir.
Tablo 1. Başlangıç faktörlerinin translasyon başlangıç hızına etkisi. Başlatıcı tRNA ve aminoasit arasındaki bağlanma olan fMET-tRNAfMet‘in birleşme hızı sabiti ka,t, ayrılma hızı sabiti kd,t, ve denge bağlanma sabiti Kd,t [3]
Hücrenin metabolizması, kodon kullanımı, RBS’nin oluşturduğu ikincil yapılar, translasyon faktörleri ve transkripsiyon hızı gibi etmenler translasyon hızını etkilemektedir. Translasyon hızının yaklaşık tahminlerinin yapılabilmesi ve optimize edilmesi için birbirinden farklı yöntemler geliştirilmektedir. Gelişen teknoloji ile machine learning teknikleri ile yeni RBS tasarımlarının yapılması için multi-armed bandit problemine dayalı çözümle geliştirilmektedir. Ancak günümüzdeki çoğu yöntem kodon optimizasyonu ve RBS tasarımı ile ilgilenmektedir [4]. RBS tasarımı içinse çoğunlukla termodinamik modeller kullanılmaktadır ancak translasyon hakkında tüm sorular cevaplanmamış olması ve hücrenin kendi kaotikliği sebebiyle %100 doğrulukla çalışmayıp yaklaşık sonuçlar vermektedir [4,5].
Kaynakça:
[1]: Laursen, B. S., Sørensen, H. P., Mortensen, K. K., & Sperling-Petersen, H. U. (2005). Initiation of protein synthesis in bacteria. Microbiology and molecular biology reviews, 69(1), 101-123.
[2]: Salis, H. M. (2011). The ribosome binding site calculator. In Methods in enzymology (Vol. 498, pp. 19-42). Academic Press.
[3]: Antoun, A., Pavlov, M. Y., Lovmar, M., & Ehrenberg, M. (2006). How initiation factors tune the rate of initiation of protein synthesis in bacteria. The EMBO journal, 25(11), 2539-2550. [4]: Zhang, M., Holowko, M. B., Zumpe, H. H., & Ong, C. S. (2022). Machine learning guided batched design of a bacterial Ribosome Binding Site. bioRxiv.
[5]: Salis, H. M., Mirsky, E. A., & Voigt, C. A. (2009). Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature biotechnology, 27(10), 946-950.